Джулиана третья дочь в семье рекламного копирайтера Пола Маргулиса и балерины Франчески Гарднер. Семья жила в Нью-Йорке, где Джулиана и появилась на свет в 1966 году 8 июня. Здесь же и прошло её детство, за исключением нескольких лет в Англии и Франции.
Джулиана закончила колледж Сары Лоуренс и получила степень бакалавра по истории искусств. В период учебы была на стажировке во Флоренции, а также принимала участие в театральных постановках. После колледжа работала официанткой, принимала участие в съемках рекламы, в театральных постановках местного театра.
Ее первая роль в кино - роль проститутки, которую она сыграла в 1991 г в фильме «Во имя справедливости». С 1993 года она появляется на телевидении. Пока доверяя ей игру второстепенных ролей в сериале, пользующемся огромной популярностью «Закон и порядок», в детективных фильмах «Она написала убийство» и «Убойный отдел».
Взлет в карьере произошел в 1994 году. В этом году Джулиану пригласили на съемки сериала «Скорая помощь», где она сыграла медсестру Кэрол Хэтуэй. Согласно первоначального сюжета её героине суждено было погибнуть, но после просмотра серий, решением продюсеров и канала NBC было оставить актрису в дальнейших съемках.
Сериал долгих пятнадцать лет собирал миллионы зрителей у экранов. В этом сериале Джулианна Маргулис работала на протяжении шести сезонов, единственная обладательница «Эмми» за игру в этом сериале.